Alamar Blue 阿爾瑪藍(lán)細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑說明書

產(chǎn)品描述

  阿爾瑪藍(lán)（Alamar Blue）是一種細(xì)胞活力檢測(cè)試劑，包含一種具細(xì)胞膜滲透性、無毒性且弱藍(lán)色熒光的指示劑，即刃天青 （resazurin）。自從1993年開始刃天青就作為一種值得信賴和可靠的試劑被引用。阿爾瑪藍(lán)是MTT（噻唑蘭）的有效且無毒 替代物。阿爾瑪藍(lán)能定量檢測(cè)人、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和支原體細(xì)胞的增殖情況，也能用于細(xì)胞因子生物活性、細(xì)胞活力分 析、體外細(xì)胞毒性確定以及細(xì)胞生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。

工作原理

刃天青（resazurin）是一種氧化還原（REDOX）指示劑，根據(jù)細(xì)胞代謝還原情況發(fā)生顏色變化。氧化態(tài)的刃天青呈紫藍(lán)色且基本無熒光，其還原態(tài)產(chǎn)物試鹵靈（resorufin）轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色且高度熒光，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與呼吸活細(xì)胞數(shù)量呈正比。通過檢測(cè) ，呼吸過程中氧化水平，阿爾瑪藍(lán)用作一種定量檢測(cè)細(xì)胞活力和毒性的直接指示劑。阿爾瑪藍(lán)的顏色變化可通過普通分光光度計(jì) 檢測(cè)吸光度變化，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為600nm；阿爾瑪藍(lán)的熒光變化可通過熒光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)在 530~560nm之間，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。

操作說明

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定最佳孵育時(shí)間和細(xì)胞數(shù)量）

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞），對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每個(gè)濃度建議3-6個(gè)復(fù)孔。注：設(shè)置陰性對(duì)照：細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入細(xì)胞；陽性對(duì)照：100微升100%還原型Alamar Blue（不含細(xì)胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue，陽性對(duì)照孔中加入10微升無菌的超純水。

3. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（37℃,5% CO2）一定時(shí)間，培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。

4. 推薦用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm。

5. 普通分光光度計(jì)在570nm測(cè)定吸光度，參考波長(zhǎng)600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以細(xì)胞數(shù)量或孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)（X軸），Alamar Blue還原率為縱坐標(biāo)（Y軸）。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出適合的細(xì)胞數(shù)量或孵育時(shí)間（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致）。

a）公式 1：通過吸光值來計(jì)算還原率

Alamar Blue 還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-（E600′×C570）] ×100；

E600=氧化態(tài) Alamar Blue 在 600nm 波長(zhǎng)的消光系數(shù)；

E570=氧化型 Alamar Blue 在 570nm 波長(zhǎng)的消光系數(shù)；

A600=檢測(cè)孔在 600nm 波長(zhǎng)的吸光值；

A570=檢測(cè)孔在 570nm 波長(zhǎng)的吸光值；

E570′=還原態(tài) Alamar Blue 在 570nm 波長(zhǎng)的消光系數(shù)；

E600′=還原態(tài) Alamar Blue 在 600nm 波長(zhǎng)的消光系數(shù)；

C570=陰性對(duì)照孔在 570nm 波長(zhǎng)的吸光值（不加細(xì)胞的培養(yǎng)基+Alamar Blue）；

C600=陰性對(duì)照孔在 600nm 波長(zhǎng)的吸光值（不加細(xì)胞的培養(yǎng)基+Alamar Blue）；

b）公式 2：通過熒光值來計(jì)算還原率

Alamar Blue 還原率（％）=（實(shí)驗(yàn)組 FI 590-陰性對(duì)照組 FI 590）/（100%還原態(tài) Alamar Blue 陽性對(duì)照 FI 590-陰性對(duì)照組 FI 590）×100

FI 590=590nm 發(fā)射波長(zhǎng)（560nm 激發(fā)波長(zhǎng)）下的熒光強(qiáng)度；

6. 繪制在每個(gè)特定細(xì)胞密度或孵育時(shí)間 Alamar Blue 的還原率。

a）對(duì)確定最佳細(xì)胞密度的實(shí)驗(yàn)，以細(xì)胞密度的對(duì)數(shù)（log）為 x 坐標(biāo)，Alamar Blue 還原率為縱坐標(biāo)；

b）對(duì)確定最佳孵育時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，以孵育時(shí)間為 x 坐標(biāo)，Alamar Blue 還原率為縱坐標(biāo)；

c）根據(jù)以上曲線圖來確定最佳細(xì)胞密度或孵育時(shí)間。

二、細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖檢測(cè)

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞），對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。建議細(xì)胞數(shù)量為104/ml，具體每孔需要的細(xì)胞數(shù)量，需根據(jù)細(xì)胞類型決定。

2. 細(xì)胞中加入待檢測(cè)藥物，為檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的作用，請(qǐng)?jiān)O(shè)置合適的對(duì)照組，包括刺激細(xì)胞和非刺激細(xì)胞。

3. 混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO2）一段時(shí)間。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽性對(duì)照孔中加入10微升無菌的超純水。

5. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO2）4-8h，最佳孵育時(shí)間取決于細(xì)胞類型。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。

6. 推薦用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm。

7. 普通分光光度計(jì)在570nm測(cè)定吸光度，參考波長(zhǎng)600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

a）公式 3：通過吸光值來計(jì)算還原度的變化百分比

Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[( E600×P570)-（E570×P600）] ×100

E600=氧化態(tài) Alamar Blue 在 600nm 波長(zhǎng)的消光系數(shù)；

E570=氧化態(tài) Alamar Blue 在 570nm 波長(zhǎng)的消光系數(shù)；

A600=檢測(cè)孔在 600nm 波長(zhǎng)的吸光值；

A570=檢測(cè)孔在 570nm 波長(zhǎng)的吸光值；

P570=陽性對(duì)照孔在 570nm 波長(zhǎng)的吸光值（不含待測(cè)藥物的細(xì)胞+ Alamar Blue）

P600=陽性對(duì)照孔在 600nm 波長(zhǎng)的吸光值（不含待測(cè)藥物的細(xì)胞+ Alamar Blue）

結(jié)果判斷：假如 Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=62%，說明相對(duì)于對(duì)照孔，檢測(cè)孔 Alamar Blue 的還原變化值為 62%，換句話而言，相對(duì)于對(duì)照孔，38%的檢測(cè)孔細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。

b）公式 4：通過熒光值來計(jì)算還原度的變化百分比

Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=（實(shí)驗(yàn)組 FI 590/陰性對(duì)照組 FI 590）×100 FI 590=590nm 發(fā)射波長(zhǎng)（560nm 激發(fā)波長(zhǎng)）下的熒光強(qiáng)度；

結(jié)果判斷：假如 Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=25%，說明相對(duì)于對(duì)照孔，檢測(cè)孔 Alamar Blue 的 還原變化值為 25%，換句話而言，相對(duì)于對(duì)照孔，75%的檢測(cè)孔細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。

運(yùn)輸與保存方法

保存：4℃避光保存，至少一年有效。運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 還原態(tài)的 Alamar Blue 在水或水溶性緩沖液如 PBS 中很不穩(wěn)定，但在培養(yǎng)基內(nèi)非常穩(wěn)定。為了確定特定實(shí)驗(yàn)還原態(tài) Alamar Blue 的吸光度/熒光值，需準(zhǔn)備 100%還原態(tài) Alamar Blue 試劑：將 Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基（含血清）按照 1:10 的比例混合，121℃高壓滅菌 15min 即可。由于熒光值定義比較隨意，儀器不同熒光值都可能發(fā)生變化，因此，測(cè)定 100%還原態(tài) Alamar Blue 熒光值時(shí)必須要和樣本測(cè)定使用相同的儀器和培養(yǎng)基。

2） 適宜的細(xì)胞密度能夠增加檢測(cè)靈敏度。對(duì)于 96 孔板，建議每孔接種 100μl 細(xì)胞，細(xì)胞濃度范圍：貼壁細(xì)胞為 100-10,000 個(gè)/孔，懸浮細(xì)胞在 2,000-50,000 個(gè)/孔，以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。對(duì)于 384 孔板，細(xì)胞濃度和接種量均減半。

3） 影響細(xì)胞對(duì) Alamar Blue 反應(yīng)的兩大變量為孵育時(shí)間和鋪板密度，建議實(shí)驗(yàn)前需先摸索優(yōu)化這兩個(gè)因素。細(xì)胞密度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性還原反應(yīng)，紅色產(chǎn)物停止增加并開始衰減，導(dǎo)致吸光度/熒光水平明顯下跌并伴隨紅色消失。

4） 微生物污染會(huì)還原 Alamar Blue。因此對(duì)被污染細(xì)胞使用 Alamar Blue 檢測(cè)會(huì)引起錯(cuò)誤結(jié)果。

5） Alamar Blue 可以用分光光度計(jì)或熒光計(jì)檢測(cè)，但熒光靈敏度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，推薦熒光檢測(cè)。

6） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。